Model of decomposition of the native absorption spectrum of Porphyridium purpureum culture

Full Text

Введение
Водоросли рода Porphyridium известны тем, что продуцируют фикобилипротеины, полиненасыщен-
ные жирные кислоты и экзополисахариды [1]. Фикобилипротеины − это группа окрашенных, водорас-
творимых белков, составляющих основной комплекс светособирающих пигментов цианобактерий, крас-
ных водорослей, глаукоцистофитов и криптофитов. Фикоэритрин является основным пигментом красных
морских водорослей, составляющим 60–80 % от общего количества растворимых белков [2]. Также пиг-
менты представлены хлорофиллом а и каротиноидами (преимущественно бета-каротин и зеоксантин).
Хлорофилл а — основной фотосинтетический пигмент микроводорослей, а такие каротиноиды, как бета-
каротин и зеоксантин, являются фотопротекторными пигментами и передают энергию на хлорофилл
при фотоситезе [3].
Количественное содержание пигментов в культуре микроводорослей представляет ценную информа-
цию о физиологическом состоянии, однако их определение достаточно сложная и трудоемкая задача [4].
Среди множества доступных современных методов наиболее используемыми являются микроволновая
экстракция, ультразвуковая экстракция, гомогенизация под высоким давлением, экстракция сверхкри-
тическими жидкостями и ускоренная экстракция растворителем (также называемая экстракцией жидко-
стью = растворителем под давлением или субкритической экстракцией растворителем) [5; 6]. При работе
с интенсивными культурами микроводорослей достаточно часто возникает необходимость определения
пигментов, не прибегая к экстракции и не вмешиваясь в процессы роста культуры. Определение пигмен-
тов in vivo — это быстрый метод без разрушения клеток. Одним из способов вычисления концентрации
пигментов в нативном состоянии является анализ спектров поглощения культуры микроводорослей с
помощью математического моделирования [7].
Таким образом, целью данной статьи является разработка математической модели спектра погло-
щения культуры Porphyridium purpureum, которая позволяла бы определять концентрации основных
фотосинтетических пигментов: хлорофилла а, В-фикоэритрина и суммарных каротиноидов.
1. Материалы и методы исследования
Экспериментальные работы выполняли на базе кафедры "Физика" СевГУ. В работе использовалась
красная морская водоросль Porphyridium purpureum (Bory) Drew et Ross (Rhodophyta). Культуру P. purpureum
выращивали в накопительном режиме, используя среду для красных морских водорослей [8], в
плоскопараллельном фотобиореакторе объемом 1,2 л, рабочая толщина культуры — 2 см [9]. Нижняя
грань фотобиореактора расположена под углом с целью улучшения перемешивания суспензий микро-
водорослей и цианобактерий. Сверху культиватор закрывался пластиковой крышкой, в которой было
выполнено отверстие для подачи воздуха, а также был оснащен системой охлаждения ("водяной ру-
башкой"), обеспечивающей поддержание температуры.
В качестве источника освещения использовали горизонтальную световую решетку из светодиод-
ных ламп LCD Feron LB-213 мощностью 10 Вт. В эксперименте освещенность составляла 5 клк или
17 Вт·м−2. Температуру стабилизировали на уровне 25 ± 1 ◦C. Барботаж культуры осуществляли ак-
вариумным компрессором Hailea ACO-308 воздухом через аквариумный распылитель, представляющий
собой пластиковую трубку длиной 5 см, диаметром 5 мм, у которой диаметр пор не превышает 0,1 мм.
Скорость подачи воздуха составляла 1 л·л−1 культуры в минуту. Дополнительного введения углекислого
газа не производилось.
Отбор проб для определения оптической плотности проводили из разных точек внутри фотобио-
реактора: отбирали по 5 мл суспензии клеток водорослей, получая таким образом "среднюю пробу"
объемом 30 мл. В средней пробе после перемешивания определяли коэффициент пропускания. Оптиче-
скую плотность рассчитывали по формуле: D = – lg(T), где Т — величина пропускания, определяемая
на фотометре КФК-2 при длине волны 750 нм, погрешность измерения величины пропускания не превы-
шала 1 %. Кюветы располагали максимально близко к фотоприемнику, что позволяло снизить ошибку
измерения оптической плотности культуры, связанную со светорассеянием. Пробы c оптической плот-
ностью выше единицы предварительно разбавляли свежей питательной средой, подбирая коэффициент
разбавления таким образом, чтобы показания КФК-2 попадали в диапазон наименьшей погрешности
(0,2 — 0,6 единиц).
Для определения сухого веса 5–10 мл суспензии центрифугировали в течение 10 минут при 3000
об·мин−1, сливали надосадочную жидкость, осадок промывали дистиллированной водой, повторно
центрифугировали и сушили в течение суток при 55 ◦C. В результате получена линейная зависи-
мость сухого веса от оптической плотности D750, а коэффициент пропорциональности составил k =
= 0; 7 г СВ·л−1·ед. опт. пл−1.
124
Чернышёв Д.Н., Клочкова В.С., Лелеков А.С. Модель декомпозиции нативного спектра поглощения культуры...
Chernyshev D.N., Klochkova V.S., Lelekov A.S. Model of decomposition of the native absorption spectrum...
Пробы для определения содержания пигментов отбирали ежедневно на различных фазах роста нако-
пительной культуры после тщательного перемешивания. Концентрации хлорофилла а, В-фикоэритрина
и суммарных каротиноидов (далее — хл а, В-ФЭ, кр) определяли согласно стандартным методикам
[10–12]. После отбора проб из фотобиореактора проводили центрифугирование при 3000 об·мин−1, на-
досадочную жидкость сливали. Далее проводили несколько циклов "замораживание-оттаивание" в мо-
розильной камере при -18 ◦C. Затем В-ФЭ экстрагировали водным буферным раствором с рН 7–7,5.
После изменения цвета осадка (из красного на зеленый), с помощью ацетона выделяли хл а. Спектры
экстрактов пигментов записывали на спектрофотометре Unico в кварцевых 1 см кюветах в диапазоне
длин волн 400 — 800 нм с шагом 0,5 нм. Регистрировали оптическую плотность полученных экстрактов
в области характеристических максимумов поглощения В-ФЭ (545 нм), R-фикоцианина (615 нм), алло-
фикоцианина (650 нм), хл а (663 нм) и кр (480 нм). Концентрацию В-ФЭ определяли по [10], хл а [11],
кр [12] с учетом объемов экстрактов и массы навесок:
CBPE =
D650
"APC
+
D615
"RPC
+
D545
"BPE
; (1)
Cchla =
D663
"chla
; (2)
Ccar =
D480
"car
; (3)
где D650, D615, D545, D680, D480 — значения оптических плотностей в соответствующей длине вол-
ны; "BPE — экстинкция В-фикоэритрина 10 (л·г−1·см−1); "RPC — экстинкция R-фикоцианина 7
(л·г−1·см−1); "APC — экстинкция аллофикоцианина 5,8 (л·г−1·см−1); "chla — экстинкция хлорофил-
ла а 88,15 (л·г−1·см−1); "car — экстинкция суммарных каротиноидов 2500 (л·г−1·см−1).
Спектры поглощения культуры регистрировались в диапазоне от 400 до 800 нм с шагом 0,5 нм на
двухлучевом спектрофотометре Lambda 365 Double Beam UV-Visible (производитель: Perkin Elmer, Ин-
дия), который оснащен интегрирующей сферой (ИС) диаметром 60 мм (внешнее покрытие — BaSO4).
Для определения концентрации пигментов методом кривых Гаусса необходим истинный спектр погло-
щения, компенсированный на рассеяние, который определяли по формуле [13]:
A~ = D(; r) − L(r; 0) · [D(; r) − D(; 0)] ; (4)
где D(;r) — оптическая плотность образца, расположенного на некотором расстоянии r от ИС; L(r;0) —
поправочный коэффициент ослабления света;D(;0) — оптическая плотность образца при стандартном
положении кюветы.
2. Результаты и их обсуждение
Экспериментальные результаты
На рис. 1, A представлена накопительная кривая роста культуры P. purpureum, которая характери-
зуется наличием ярко выраженных экспоненциальной и линейной фаз роста.
Биомасса культуры за две недели эксперимента увеличилась почти в 50 раз и достигла 1,7 г СВ·л−1,
что с учетом толщины фотобиореактора (1 см) составляет 17 г СВ·м−2. Экспоненциальная и линейная
фазы роста культуры описывались выражениями:
B = B0 · em·t; B = Bl + Pm · (t − tl) ; (5)
где В0 — начальная плотность культуры,г СВ·л−1; m — максимальная удельная скорость роста, которая
составила 0,7 сут−1; Вl — плотность культуры на момент начала линейного роста tl; Pm — максимальная
продуктивность, значение которой составило 0,21 г СВ·л−1·сут−1.
Проведенные расчеты позволяют предположить, что рост порфиридиума начиная с третьих суток
эксперимента был ограничен потоком углекислого газа. В работе [14] показано, что максимальная про-
дуктивность культуры P. purpureum достигала 0,42 г СВ·л−1·сут−1 при такой же освещенности и ра-
бочем слое культуры.
На рис. 1, B представлена динамика истинных спектров поглощения, компенсированных на рассе-
яния, определенные по формуле (4). Получим математическую модель, позволяющую описать такие
данные и определить концентрации основных фотосинтетических пигментов.
Модель спектра поглощения
При анализе нормированного в точке максимума (678 нм) спектра поглощения культуры
P. purpureum, для достоверного выявления пиков была вычислена производная второго порядка.
Вестник Самарского университета. Естественнонаучная серия 2024. Том 30, № 1. С. 122–131
Vestnik of Samara University. Natural Science Series 2024, vol. 30, no. 1, pp. 122–131 125
A B
Рис. 1. Накопительная кривая роста культуры P. purpureum (А). Сплошные линии — аппроксимации
экспоненциальной (0 — 3 сутки) и линейной (3 — 8 сутки) фаз. Истинные спектры поглощения
культуры P. purpureum, скомпенсированные на рассеяние (В)
Fig. 1. Batch growth curves of P. purpureum culture (А). Solid lines are approximations of exponential
(0 — 3 days) and linear (3 — 8 days) phases. True absorption spectra of P. purpureum culture
compensated for scattering (В)
Контур второй производной похож на спектр поглощения, но его полосы имеют более тонкую органи-
зацию [15]. Производная второго порядка (отрицательные области) позволяет точно выявить скрытые
дополнительные максимумы в общем спектре поглощения (рис. 2, A). Можно предположить, что выяв-
ленные явные максимумы связаны с определенными полосами поглощения основных пигментов красной
микроводоросли P. purpureum. Полученные данные послужили начальными точками максимумов пиков
при аппроксимации спектра кривыми Гаусса. Каждый отдельный пик был описан формулой (6):
D() = Dmax · e
−0;5·
(
i
????max

)2
(6)
где D() — оптическая плотность, отн. ед; Dmax — амплитуда пика, отн. ед; i — длина волны, нм;
max — положение максимума пика, нм; — полуширина пика, нм.
Для описания спектра поглощения нативной формы хлорофилла а в работах [7; 16] приводится 4 кри-
вых Гаусса с максимумами 415, 435, 623, 675 нм. Пик хл а в области 680 нм необходимо разделить на
2 кривых (673 и 683 нм). Такое разделение основано на дифференциальном спектре — появление двух
максимумов в области 680 нм. Аппроксимация спектра поглощения культуры P. purpureum подтверди-
ла, что в области 680 нм пик хл а необходимо разделять на две составляющие, при этом коэффициент
детерминации приближается к 1 (рис. 2, B). Нативные каротиноиды у [16] описываются двумя кривы-
ми Гаусса с максимумами 489, 532 нм. В нашем случае (рис. 2, C) в процессе приближения функции
к нативному спектру поглощения получены 2 кривые Гаусса с максимумами 465 и 490 нм. У фикоби-
линовых пигментов форма и положение максимумов практически не изменяются при переходе от экс-
трактов к нативным формам [10; 17]. На основе полученных данных о спектрах поглощения пигментов
на рис. 2, (B – F) приведены модели отдельных пигментов.
Таким образом, модель спектра поглощения культуры P. purpureum представляет собой сумму спек-
тров хл а и В-ФЭ, R-фикоцианина, аллофикоцианина и кр:
D() = DBPE() + DRPC() + DAPC() + Dchla() + Dcar(); (7)
DBPE() = CBPE · "BPE
(
0; 25 · e
−0;5
(
i
????493;3
19;0
)2
+ 0; 99 · e
−0;5
(
i
????543;2
23;2
)2
+ 0; 4 · e
−0;5
(
i
????570;1
8;3
)2)
;
DRPC() = CRPC · "RPC
(
0; 31 · e
−0;5
(
i
????545;3
32;8
)2
+ 0; 26 · e
−0;5
(
i
????552;7
12;9
)2
+
+0; 33 · e
−0;5
(
i
????585;9
14;3
)2
+ 0; 94 · e
−0;5
(
i
????617
14;4
)2)
;
126
Чернышёв Д.Н., Клочкова В.С., Лелеков А.С. Модель декомпозиции нативного спектра поглощения культуры...
Chernyshev D.N., Klochkova V.S., Lelekov A.S. Model of decomposition of the native absorption spectrum...
Рис. 2. Спектр поглощения культуры микроводоросли P. purpureum, нормированный по значению
D678 и вторая производная спектра (умноженная на (-100)) (A). Математическая модель спектра хл а
(B), кр (C), В-ФЭ (D), R-фикоцианина (E) и аллофикоцианина (F)
Fig. 2. Absorption spectrum of microalgae P. purpureum normalized by D678 value and the second derivative of
the spectrum (multiplied by (-100))(multiplied by (-100)) (A). Mathematical model of the spectrum of chl a (B),
car (C), B-PE (D), R-ficocyanin (E), and allophicocyanin (F)
DAPC() = CAPC · "APC
(
0; 24 · e
−0;5
(
i
????590;5
37;7
)2
+ 0; 40 · e
−0;5
(
i
????613;6
20;6
)2
+
+0; 43 · e
−0;5
(
i
????642;3
14;1
)2
+ 0; 64 · e
−0;5
(
i
????657;6
7;3
)2)
;
Dchla() = Cchla · "chla
(
0; 38 · e
−0;5
(
i
????633;6
40;8
)2
+ 0; 53 · e
−0;5
(
i
????673;6
12;3
)2
+
+0; 35 · e
−0;5
(
i
????683;3
8;1
)2
+ 1; 39 · e
−0;5
(
i
????440;2
12;99
)2
+ 0; 45 · e
−0;5
(
i
????417;8
9;03
)2)
;
Dcar() = Ccar · "car
(
0; 59 · e
−0;5
(
i
????465;5
9;1
)2
+ 0; 88 · e
−0;5
(
i
????491;8
19;8
)2)
;
где D() — общая оптическая плотность; DBPE() — оптическая плотность В-фикоэритрина; DRPC() —
оптическая плотность R-фикоцианина; DAPC() — оптическая плотность аллофикоцианина; Dchla() —
оптическая плотность хлорофилла а; Dcar() — оптическая плотность суммарных каротиноидов;
CBPE — концентрация В-фикоэритрина (г·л−1); CRPC — концентрация R-фикоцианина (г·л−1); CAPC —
концентрация аллофикоцианина (г·л−1); Cchla — концентрация хлорофилла а (г·л−1); Ccar — концен-
трация суммарных каротиноидов (г·л−1); "BPE — экстинкция В-фикоэритрина 10 л·г−1·см−1; "RPC —
экстинкция R-фикоцианина 7 л·г−1·см−1; "APC — экстинкция аллофикоцианина 5,8 л·г−1·см−1; "chla —
экстинкция хлорофилла а 88,15 л·г−1·см−1; "car — экстинкция суммарных каротиноидов 2500 л·г−1·см−1.
На рис. 3 представлен пример разделения спектра поглощения культуры микроводоросли P.
purpureum на отдельные кривые Гаусса методом аппроксимации моделью (7). Предлагаемый способ де-
композиции спектра может быть использован как экспресс-метод определения концентрации пигментов
без их выделения в чистом виде, что важно при работе с накопительными культурами без вмешатель-
ства в процессы их роста.
Верификация модели
Для верификации полученных результатов была проведена серия параллельных измерений концен-
трации хл а, кр и В-ФЭ по стандартным методикам и предлагаемой модели (7). Сравнение результатов
представлено на рис. 4.
Согласно рис. 4, значения концентраций В-ФЭ, хл а и кр, полученные с помощью стандартного мето-
да, а также концентрации, определенные методом разложения истинных спектров поглощения на кривые
Гаусса, коррелируют между собой с высокой точностью (R2>0,95). Для определения концентрации хл а
в обоих методах использовался коэффициент экстинкции в ацетоновом экстракте 88,15 л·г−1·см−1 [18].
Вестник Самарского университета. Естественнонаучная серия 2024. Том 30, № 1. С. 122–131
Vestnik of Samara University. Natural Science Series 2024, vol. 30, no. 1, pp. 122–131 127
Рис. 3. Пример разделения спектра поглощения культуры микроводоросли P. purpureum на отдельные
кривые Гаусса методом аппроксимации. Черными точками показан спектр поглощения культуры;
зеленая линия — спектр хлорофилла а, розовая — В-фикоэритирина; фиолетовая — R-фикоцианина;
синяя — аллофикоцианина; желтая — суммарных каротиноидов; красная — суммарная модель спектра
Fig. 3. Example of separation of the absorption spectrum of the microalgae P. purpureum into separate Gaussian
curves by approximation. Black dots show the absorption spectrum of the culture; green line — chlorophyll a
spectrum, pink — B-phycoerythyrin; purple — R-phycocyanin; blue — allophycocyanin; yellow — total carotenoids;
red — total spectrum model
A B C
Рис. 4. Концентрация В-фикоэритрина (A), хлорофилла а (B) и суммарных каротиноидов (C),
определенных по стандартной методике (1–3) и при помощи модели (6). Значения углов наклона
прямой во всех вариантах близки к 1 (R2>0,95)
Fig. 4. Concentrations of B-phycoerythrin (A), chlorophyll a (B) and total carotenoids (C) determined using the
standard technique (1–3) and model (5). The values of the angles of slope of the straight line in all variants are
close to 1 (R2>0,95)
Известно, что нативный коэффициент экстинкции не совпадает с эталонным значением для ацетонового
экстракта. В работе [19] коэффициент экстинкции хлорофилла а в нативной форме равен 76 л·г−1·см−1,
а по данным [20] нативный коэффициент экстинкции хлорофилла а составляет 67,5 л·г−1·см−1 в макси-
муме поглощения 678 нм. Одним из объяснений различия между нативным коэффициентом экстинкции
и коэффициента экстинкции в ацетоновом растворе является эффект "упаковки" пигментов в клетках.
Результаты расчетов показывают, что при экстинкции хл а 88,15 л·г−1·см−1 коэффициент корреляции
(тангенс угла наклона) равен 0,9 (рис. 4 Б). Если при расчете концентрации хл а с помощью модели (7)
использовать экстинкции 100 л·г−1·см−1, то коэффициент корреляции будет равен 1. Коэффициенты
экстинкции В-ФЭ и кр не изменяются при переходе от экстрактов к нативным формам, поэтому в мо-
дели их значения составили 10 л·г−1·см−1 и 2500 л·г−1·см−1 соответственно. Следует отметить, что для
128
Чернышёв Д.Н., Клочкова В.С., Лелеков А.С. Модель декомпозиции нативного спектра поглощения культуры...
Chernyshev D.N., Klochkova V.S., Lelekov A.S. Model of decomposition of the native absorption spectrum...
определения концентрации фикобилипротеинов и суммарных каротиноидов необходимо аппроксимиро-
вать спектр поглощения культуры моделью (7). Для расчета концентрации хл а достаточно использовать
значение оптической плотности при длине волны 680 нм, которое необходимо разделить на экстинкцию,
так как поглощение других пигментов не влияет на оптическую плотность в этой области.
Заключение
В работе на основе анализа методов определения концентрации основных фотосинтетических пиг-
ментов: В-фикоэритрина, хлорофилла а и суммарных каротиноидов разработана модель спектра
поглощения культуры P. purpureum. Установлено, что метод кривых Гаусса с высокой точностью кор-
релирует со стандартными биохимическими методиками и может быть использован как экспресс-метод
определения концентрации основных фотосинтетических пигментов P. purpureum без вмешательства в
ход эксперимента. Однако предложенная модель не позволяет провести разделение каротиноидов (бета-
каротина и зеоксантина). Отметим, что при работе с моделью (7) необходимо использовать только истинный спектр поглощения культуры, который, в свою очередь, должен быть записан на спектрофотометре, оснащенном интегрирующей сферой.
Работа выполнена в рамках госзадания ФИЦ "Институт биологии южных морей имени А.О. Ковалевского РАН", "Комплексное исследование механизмов функционирования биотехнологических комплексов с целью получения активных веществ из гидробионтов" (№ гос. регистрации 1023032700554-2-1.6.16)

About the authors

D. N. Chernyshev

Sevastopol State University

Author for correspondence.
Email: chernishevd@gmail.ru
ORCID iD: 0000-0002-8120-7382

head of laboratory, Department of Physics

33, Universitetskaya Street, Sevastopol, 299053, Russian Federation

V. S. Klochkova

Sevastopol State University

Email: viki-iki@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-2120-9589

engineer, Department of Physics

33, Universitetskaya Street, Sevastopol, 299053, Russian Federation

A. S. Lelekov

A.O. Kovalevsky Institute of Biology of the Southern Seas

Email: a.lelekov@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-1213-7963

Candidate of Biological Sciences, senior researcher, Department of Biotechnology and Phytoresources

2, Nakhimov Avenue, Sevastopol, 299011, Russian Federation

References

Supplementary files