ROLE OF GABAERGIC AND GLUTAMATERGIC MECHANISMS OF PARAFACIAL REGION IN REGULATION OF RESPIRATION IN RATS

Full Text

В последние годы заметно усилился ин- на изменение уровня СО2 и Н в ликворе [3; 4], терес исследователей к парафациальной обла- что определяет решающее значение этого ядра сти мозгового ствола, в которой содержатся в процессах центральной хеморецепции [5; 6]. нейронные структуры, выполняющие важную в Известно, что нейроны РТЯ в своём большин- роль в центральных механизмах регуляции ды- стве являются глутаматергическими [6; 10], а хания. Одной из таких структур является ре- VGLUT1-3-иммунореактивные терминали слу- тротрапециевидное ядро (РТЯ), представляю- жат вероятным маркером хемосенсорных кле- щее собой гетерогенную группу нейронов, ло- ток этого ядра. Определённая часть хемосен- кализованных вентральнее моторного ядра ли- сорных нейронов РТЯ обладает Phox2b- цевого нерва и примыкающей к нему части ла- иммунореактивностью, они переслаиваются с терального гигантоклеточного ядра в непосред- пре-инспираторными нейронами парафациаль- ственной близости к вентральной поверхности ной респираторной группы (пФРГ), играющи- продолговатого мозга [1]. В области РТЯ име- ми главную роль в генерации дыхательной ются дыхательные нейроны [2], но более широ- ритмики [7]. Особая функция нейронов области ко здесь представлены нейроны, реагирующие РТЯ/пФРГ состоит в обеспечении трансформа- ции пассивной фазы экспирации в активную © Будаев А. И., Ведясова О. А., Ковалева Т. Е., фазу [8-10]. То есть парафациальный регион Федотова И. Г., 2017. (РТЯ/пФРГ) оказывает регулирующее влияние Будаев Александр Иванович на разные аспекты дыхательной функции. (budaev.sasha@mail.ru), РТЯ тесно связано со многими отдела- магистрант биологического факультета; ми центральной нервной системы, в том Ведясова Ольга Александровна (o.a.vedyasova@gmail.com), числе с респираторной нейронной сетью. профессор кафедры Нисходящие проекции от РТЯ выявлены в физиологии человека и животных; спинном мозге, парабрахиальном комплексе, Ковалева Татьяна Евгеньевна ядре одиночного пути, во всех отделах вен- (kovalova.t.e@gmail.com), тральной респираторной группы [10; 11], что аспирант кафедры физиологии человека и животных; позволяет центральным хеморецепторным Федотова Ирина Григорьевна структурам включаться в регуляцию дыха- (fedorina94@mail.ru), ния. Активность нейронов РТЯ/пФРГ кон- магистрант биологического факультета тролируется различными нейрохимическими Самарского университета, механизмами, например, в краевом слое РТЯ 443086, Россия, г. Самара, Московское шоссе, 34. 16 Биология обнаружены густые сплетения терминалей, путём разведения в искусственной спинномоз- иммунореактивных к маркерам глутамат-, говой жидкости. Растворы инъецировали в ГАМК-, адрен-, серотонин-, холин- и пепти- РТЯ в объёме 0,2 мкл через стеклянную мик- дергической трансмиссии [11; 12]. Среди роканюлю с диаметром кончика 50 мкм, за- этих нейроактивных веществ особый интерес креплённую на игле микрошприца МШ-1, по вызывает ГАМК как важнейший тормозной следующим стереотаксическим координатам: нейромедиатор и глутамат как главный воз- 2,2 мм каудальнее lambda; 1,8 мм латеральнее дорсальной буждающий нейромедиатор, которые на срединного шва; 10,6 мм вглубь от уровне дыхательного центра принимают поверхности мозга [3]. Контрольным живот- непосредственное участие в регуляции пат- ным (n = 6) аналогичным образом в РТЯ вво- терна дыхания [13-15] и формировании ре- дили 0,2 мкл искусственной спинномозговой спираторного ритма [16; 17]. В ряде работ жидкости. Достоверных изменений внешнего показан определённый вклад ГАМК и глута- дыхания и биоэлектрической активности ды- мата в регуляцию дыхания структурами па- хательных мышц в контроле не наблюдалось, рафациальной области, но их авторы глав- поэтому о характере респираторных эффектов ным образом анализируют модулирующее мусцимола и L-глутамата у эксперименталь- влияние ГАМК- и глутаматергических меха- ных животных судили на основании сравнения низмов РТЯ на респираторные эффекты, наблюдаемых изменений с исходными значе- обусловленные гиперкапнией и гипоксией ниями. [8; 18]. Респираторные эффекты оценивали по Цель нашего исследования заключалась изменению паттерна внешнего дыхания, ко- в изучении реакций дыхания, вызываемых ак- торый регистрировали при помощи спиро- тивацией ГАМКА- и глутаматергических ре- графической методики. Использовали мини- цепторов в области РТЯ у крыс в условиях атюрный спирограф, подсоединяемый к жи- дыхания нормальным атмосферным воздухом. вотному через трахеостомическую трубку. От спирографа сигналы через специальное Условия и методы исследования преобразующее устройство поступали на Исследование выполнено в острых экс- персональный компьютер. Спирограммы за- периментах на 18-ти взрослых беспородных писывали в программе PowerGraph 3.2 Pro- крысах обоего пола, массой 200-250 г. По- fessional (ООО «Интероптика-С») в исход- ставлены три серии опытов - две экспери- ном состоянии и в течение 60-ти минут по- ментальных и контрольная (по 6 крыс в каж- сле введения растворов в РТЯ. На получен- дой). Все этапы исследования осуществля- ных спирограммах определяли длительность лись в строгом соответствии с правилами дыхательного цикла (Тц, c), время экспира- биологической этики. Крыс наркотизировали торной (Твыд, c) и инспираторной (Tвд, c) уретаном (1,6 мг/кг массы, внутрибрюшин- фаз, дыхательный объём (ДО, мл). Частоту -1 но). После наркотизации крысам проводи- дыхания (ЧД, мин ) рассчитывали по фор- лась операция трахеотомии, в трахею вводи- муле ЧД = 60/Tц. Минутный объём дыхания лась пластиковая канюля, затем животных (МОД, мл/мин) также определяли методом переворачивали спиной кверху, делали раз- расчёта по формуле МОД = ДО×ЧД. рез кожи на голове и очищали поверхность Экспериментальные данные подвергали черепа. После этих процедур крыс переноси- статистической обработке в программе Sig- ли в стереотаксический прибор СЭЖ-3, фик- maPlot 12.5 («Systat Software» Inc.). Уровень сировали головы в горизонтальной плоско- значимости (p) определяли при помощи Paired сти и высверливали трепанационное отвер- t-test и Wilcoxon Signed Rank Test. Все данные стие в затылочной кости, необходимое для выражали как средние арифметические ± осуществления микроинъекций в РТЯ. ошибки среднего. Статически достоверными Для микроинъекций крысам опытных считали изменения со значениями p < 0,05. групп использовали растворы мусцимола (се- лективного агониста ГАМКА-рецепторов) в Результаты и их обсуждение -7 концентрации 10 М (n = 6) и L-глутамата в Микроинъекции в РТЯ крыс раствора -8 -7 концентрации 10 М (n = 6), приготовленные мусцимола (10 М) приводили к изменениям Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета. 2017. № 2 (11) 17 частотных и объёмных параметров паттерна Характерным эффектом воздействия внешнего дыхания, подтверждением чего могут мусцимола на РТЯ было увеличение про- служить представленные ниже оригинальные должительности обеих фаз дыхательного спирограммы (рис. 1). Интегральный эффект цикла, однако изменения времени вдоха воздействия агониста ГАМКА-рецепторов про- (Твд) и выдоха (Твыд) развивались с разной являлся угнетением лёгочной вентиляции. скоростью (рис. 2). Рис. 1. Спирограммы, зарегистрированные у крысы в исходном состоянии и в разные -7 сроки после микроинъекции 10 М раствора мусцимола в ретротрапециевидное ядро Рис. 2. Изменение (% от исходного уровня) параметров паттерна внешнего -7 дыхания у крыс в разные сроки после микроинъекции 10 М раствора мусцимола в ретротрапециевидное ядро: а - длительность вдоха; б - длительность выдоха; в - частота дыхания; г - дыхательный объём. Примечание: * - достоверные отличия от исходного уровня (Wilcoxon Signed Rank Test) с уровнем значимости p < 0,05; *** - достоверные отличия от исходного уровня (Wilcoxon Signed Rank Test) с уровнем значимости p < 0,001; # - достоверные отличия от исходного уровня (Paired t-test) с уровнем значимости p < 0,05 18 Биология Так, увеличение Твд начиналось прак- Так, в исходном состоянии ДО равнялся тически сразу после введения агониста 0,85 ± 0,09 мл, к 15-й минуте он возрастал до ГАМКА рецепторов (рис. 2 а), уже на 1-й 0,96 ± 0,10 мл, а на 30-й минуте достигал минуте экспозиции данный параметр увели- 0,98 ± 0,09 мл, что соответствовало увеличе- чивался от 0,42 ± 0,04 с (исходный уровень) нию на 13,2 % (p < 0,05) и 15,1 % (p < 0,05). до 0,47 ± 0,04 с, или на 11,9 % (p < 0,001). Частота дыхания, в противополож- Максимум реакции отмечался на 50-й мину- ность ДО, при микроинъекции L-глутамата те, когда Твд увеличивалась до 0,52 ± 0,05 с, в РТЯ закономерно уменьшалась (рис. 3 и что соответствовало 23,8 % (p < 0,05) отно- 4 б). Причём эта реакция начинала форми- сительно исходного уровня. роваться раньше, чем изменение глубины Экспираторная фаза дыхательного цик- дыхания, а именно уже с 4-й минуты, когда ла менялась медленнее, но с несколько уменьшение ЧД составляло 6,6 % (p < 0,05) большей выраженностью. А именно, Твыд от исходного уровня, и продолжалась без начинала увеличиваться только с 20-й мину- особой динамики по 30-ю минуту экспози- ты после микроинъекции мусцимола в РТЯ ции (уменьшение на 8,8 %; p < 0,05). В аб- (рис. 2 б), в это время изменение составляло солютных значениях эти изменения ЧД со- 15,0 % (p < 0,05) от исходного значения ответствовали уменьшению от 57,99 ± -1 (0,59 ± 0,05 с). В последующие сроки эффект 4,55 мин (исходное состояние) до 52,90 ± -1 пролонгации выдоха нарастал, его продол- 4,03 мин (30-я минута). Сдвиги ЧД при жительность достигала 0,73 ± 0,09 с на 50-й микроинъекции L-глутамата в РТЯ были минуте и 0,75 ± 0,09 с на 60-й минуте экспо- обусловлены увеличением времени обеих зиции, что соответствовало приросту на фаз дыхания. 23,7 % (p < 0,05) и 27,5 % (p < 0,05) от ис- На рис. 4 в видно, что прирост дли- ходного значения. тельности вдоха по срокам совпадал с нача- Микроинъекции в РТЯ раствора лом уменьшения ЧД (5-я минута после мик- L-глутамата вызывали у крыс реакции внеш- роинъекции). В это время продолжитель- него дыхания, несколько отличавшиеся от ность инспираторной фазы составляла реакций на мусцимол. В первую очередь, 0,50 ± 0,02 с, что на 11,5 % (p < 0,05) превы- специфика эффектов этих нейроактивных шало исходную величину (0,43 ± 0,03 с). субстанций проявлялась в изменениях объ- Длительность выдоха при введении L-глу- ёмных параметров спирограмм. В частности, тамата в РТЯ менялась в тех же пределах, L-глутамат, в отличие от мусцимола, оказы- что и при инъекции мусцимола, однако с бо- вал стимулирующее влияние на глубину ды- лее продолжительным латентным периодом хания, на что указывает увеличение ДО у (рис. 4 г). А именно, статистически значимое крыс. Иллюстрацией этого эффекта служат увеличение Твыд отмечалось во второй по- зарегистрированные в эксперименте спиро- ловине экспозиции. На 30-й минуте Твыд граммы (рис. 3). составляла 0,66 ± 0,06 с, а на 60-й - 0,69 ± Прирост ДО при воздействии L-глута- 0,07 с, что было на 9,0 % (p < 0,05) и 12,9 % мата на РТЯ был приурочен к интервалу с (p < 0,05) выше исходной величины (0,61± 15-й до 30-й минуты наблюдений (рис. 4 а). 0,06 с). Рис. 3. Спирограммы, зарегистрированные у крысы в исходном состоянии и в разные -8 сроки после микроинъекции 10 М раствора L-глутамата в ретротрапециевидное ядро Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета. 2017. № 2 (11) 19 Рис. 4. Изменение параметров паттерна внешнего дыхания у крыс в разные сроки -8 после микроинъекции 10 М раствора L-глутамата в ретротрапециевидное ядро: а - дыхательный объём; б- частота дыхания; в - длительность вдоха; г - длительность выдоха. Примечание: * - достоверные отличия от исходного уровня (Paired t-test) с уровнем значимости p < 0,05. Что касается МОД, то его уровень при динамика фаз дыхательного цикла и, в част- микроинъекции L-глутамата в область РТЯ ности, разные латентные периоды изменений существенно не менялся, демонстрируя тен- времени вдоха и выдоха при воздействии денцию роста от 48,64 ± 4,79 мл/мин в ис- этих веществ. В опытах как с мусцимолом, ходном состоянии до 52,25 ± 6,51 мл/мин на так и с L-глутаматом вдох увеличивался че- 60-й минуте, что соответствовало 9,5 %. От- рез 1-4 минуты, а выдох - через 20-30 минут сутствие значимой динамики МОД можно после инъекции соответственно, что позво- объяснить противоположными по направ- ляет говорить об особенностях взаимодей- ленности отклонениями ДО (в сторону уве- ствия РТЯ с инспираторными и экспиратор- личения) и ЧД (в сторону снижения). ными отделами дыхательного центра в усло- Результаты проведённого исследования виях нормоксии. Наблюдаемые различия мо- свидетельствуют, что микроинъекции в РТЯ гут быть связаны с тем, что в нормальных крыс растворов мусцимола (агониста условиях участие РТЯ в регуляции выдоха, в ГАМКА-рецепторов) и L-глутамата (экзоген- том числе в формировании активной экспи- ного аналога возбуждающего нейромедиато- раторной фазы, менее выражено, чем при ра) оказывают неоднозначные влияния на гиперкапнии и/или гипоксии [8; 9]. Одно- внешнее дыхание. Так, обращает внимание временно эти результаты подтверждают точ- 20 Биология ку зрения об участии ГАМКергических и крыс на фоне гиперкапнии/гипоксии ограни- глутаматергических рецепторов РТЯ в регу- чивало усиление электромиограммы диа- ляции не только экспирации, но и инспира- фрагмы и снижало активную экспирацию ции [19]. [10], а введение агониста ГАМКА-рецепторов Основное различие в зарегистрирован- в РТЯ в нормальных условиях приводило к ных эффектах мусцимола и L-глутамата ка- уменьшению вентиляции лёгких [25]. Инъек- салось изменений объёмных показателей ции раствора, содержащего смесь блокатора паттерна дыхания. Так, инъекции в РТЯ ГАМКА-рецепторов бикукуллинa и антагони- мусцимола вызывали ослабление лёгочной ста глициновых рецепторов стрихнинина, вентиляции за счёт уменьшения глубины и стимулировали активную экспираторную фа- частоты дыхания, тогда как при введении зу и снижали частоту дыхания в сочетании с L-глутамата, несмотря на снижение частоты увеличением дыхательного объёма, что ука- дыхания, формировалась тенденция роста зывает на роль постсинаптического ГАМКА- лёгочной вентиляции благодаря увеличению и/или глицинергического торможения в ме- глубины дыхания. Из этого следует, что дей- ханизмах деятельности РТЯ [9]. ствие указанных нейроактивных веществ Что касается респираторных эффектов обусловлено соответственно торможением и введения L-глутамата в РТЯ, то их реализа- возбуждением клеток РТЯ, проецирующихся ция, вероятно, обеспечивается ионотропны- на дыхательные нейроны, контролирующие ми NMDA и non-NMDA рецепторами. Со- силу вдоха и респираторный ритмогенез. Из- гласно литературным данным, активность вестно, что проекции нейронов РТЯ идут ип- именно этих рецепторов в РТЯ у зрелых силатерально в вентральную респираторную крыс влияет на разряды диафрагмального группу, а также в вентролатеральную часть нерва, вызываемые стимуляцией централь- ядра одиночного пути [10; 11; 20], где при- ных и периферических хеморецепторов. сутствуют премоторные нейроны дыхатель- Например, в условиях гиперкапнии микро- ных мышц [21; 22]. Морфологической осно- инъекции антагонистов NMDA рецепторов и вой включения РТЯ в регуляцию активной non-NMDA рецепторов в РТЯ снижали ин- экспираторной фазы являются прямые воз- тенсивность дыхательных реакций на хими- буждающие (глутаматергические) проекции ческий стимул, тогда как антагонист метабо- нейронов парафациальной области к экспи- тропных глутаматергических рецепторов при раторным премотонейронам каудальной вен- инъекциях в РТЯ не оказывал влияния на тральной респираторной группы [10]. Кроме указанные реакции [18]. При дыхании возду- того, Phox2b-нейроны РТЯ имеют многочис- хом нормального состава микроинъекции ленные тесные контакты с нейронами ком- антагониста NMDA рецепторов в РТЯ крыс плекса пре-Бетцингера, которому отводится способствовали росту частоты и объёмных роль генератора инспираторного ритма. показателей дыхания [25]. Phox2b-нейроны РТЯ являются глутаматер- гическими и стимулируют дыхание посред- Заключение ством моносинаптического возбуждения Из полученных данных следует, что РТЯ нейронов комплекса пре-Бетцингера [20]. вносит определённый вклад в регуляцию пат- В основе действия мусцимола на РТЯ терна внешнего дыхания у зрелых крыс в лежит активация ГАМКА-рецепторов и по- условиях не только гиперкапнии/гипоксии, но следующее развитие ГАМКергического, в и нормоксии. Реализация влияний РТЯ на ды- том числе тонического, торможения, меха- хание опосредуется ионотропными ГАМКА и низмы которого описаны в ряде публикаций ионотропными глутаматергическими рецепто- [23; 24]. Наблюдаемые тормозные респира- рами, локализованными в пределах изучаемой торные эффекты активации ГАМКА- структуры. Активация ГАМКА-рецепторов рецепторов РТЯ согласуются с результатами РТЯ вызывает угнетение лёгочной вентиляции других исследований, в которых проводились за счёт уменьшения частоты дыхания и дыха- инъекции агонистов и антагонистов ГАМК в тельного объёма, тогда как активация глута- парафациальную область. Например, локаль- матных рецепторов РТЯ способствует форми- ное введение мусцимола в район РТЯ/пФРГ рованию тенденции роста лёгочной вентиля-

About the authors

Aleksandr Ivanovich Budaev

Samara University

Email: budaev.sasha@mail.ru
443086, Russia, Samara, Moskovskoye Shosse, 34

Olga Aleksandrovna Vedyasova

Samara University

Email: o.a.vedyasova@gmail.com
443086, Russia, Samara, Moskovskoye Shosse, 34

Tatyana Evgenievna Kovaleva

Samara University

Email: kovalova.t.e@gmail.com
443086, Russia, Samara, Moskovskoye Shosse, 34

Irina Grigorievna Fedotova

Samara University

Email: fedorina94@mail.ru
443086, Russia, Samara, Moskovskoye Shosse, 34

References

Supplementary files