PREPARATION, EMPLOYMENT AS CARRIERS AND RESEARCH OF ANTIBACTERIAL ACTION OF COMPOSITES ON THE BASIS OF GELS AND GEL-MEMBRANES OF BACTERIAL CELLULOSE

Full Text

Бактериальная целлюлоза (БЦ) в ближай- шем будущем может стать одним из самых пер- спективных материалов для получения компо- зитов для применения в медицине, промыш- ленности и других отраслях. Благодаря уни- кальной величине и укладки волокон полимера БЦ многими исследователями относится к наноматериалам. Наличие мелких пор, природ- ная чистота, гипоаллергенность, малая адгезия к поверхности кожи позволяют успешно ис- пользовать БЦ в качестве органической мат- рицы при создании композитов путём внесения в гель-плёнки и гелей эффективных антибакте- риальных и биостимулирующих компонентов. Целью данной работы стало получение композитов на основе гелей и «вторичных» гель-плёнок с добавлением растительных экс- трактов и антибиотических компонентов. Условия и методы исследований В качестве продуцента бактериальной целлюлозы нами была использована культура Gluconacetobacter sucrofermentas H-110. Штамм депонирован во Всероссийской Кол- лекции под регистрационным номером ВКПМ В-11267 и любезно предоставлен нам кафедрой биотехнологии, биоинженерии и биохимии Мордовского государственного университета имени Н. П. Огарева. Для получения гелей была использована среда Grande (2009). Культивирование осу- ществляли в шейкере-инкубаторе (Environ36 Биология mental Shaker-Incubator ES-20/60) в течение 5-ти суток при температуре 30 ᴼС и скоростью перемешивания 250 об/мин. Полученные гели промывали в дистиллированной воде, затем помещали в 0,1 Н раствор NaOH для очистки от оставшихся клеток на 30 минут, затем про- мывали дистиллированной водой, помещали в 0,5 % раствор HCl на 30 минут и снова про- мывали дистиллированной водой до нейтральной реакции [1]. Гели максимально освобождали от воды методом стекания через воронку с носиком малого диаметра, смеши- вали с 96 %-ным этиловым спиртом 1:1 по объёму и хранили при температуре 10-12 ᴼС. В качестве иммуностимулирующих и антибактериальных компонентов мы исполь- зовали спиртовые экстракты календулы и алоэ. Данные растения давно используются в медицинской практике. Препараты кален- дулы применяют как дезинфицирующее бак- терицидное средство против некоторых воз- будителей болезней, особенно против пред- ставителей родов стафилококков и стрепто- кокков. Лечебные свойства календулы лекар- ственной основаны на содержании в сырье комплекса биологически активных веществ: каротина (провитамина А), стеринов, тритер- пеноидов, флавоноидов, эфирных масел, ку- маринов, макро- и микроэлементов и других. Сок алоэ обладает бактерицидным и бакте- риостатическим действием в отношении мно- гих групп микробов: стрептококков, стафил- лококков, дифтерийной, брюшнотифозной и дизентерийной палочек. Алоэ обладает мощ- ными ранозаживляющими свойствами, повы- шает иммуннореактивные способности орга- низма, а также является великолепным био- стимулятором. Листья и сок алоэ древовид- ного содержат антропроизводные: алоин, изо- барбалоин, рабарберон, ферменты, вита- мины, фитонциды, следы эфирных масел и ряд минеральных веществ (К, Са, Сu, Mg, Ba, Zn, Li) и другие биологически активные ве- щества. Спиртовые экстракты календулы и алоэ готовили по аптечной рецептуре: экстрагиро- вали 70 %-ным этиловым спиртом (для кален- дулы - 1 г сухих цветков на 10 мл спирта; для алоэ - 1 мл сока алоэ на 2 мл этилового спирта), фильтровали через 2-3 слоя марли, хранили в тёмной посуде и защищённом от света прохладном месте в течение 7-ми суток. Для получения композитов «вторичных» гель-плёнок в гель добавляли экстракты кален- дулы или алоэ в соотношении 1:1. В качестве контроля использовались гели с добавлением 96 % этилового спирта в соотношении 1:1. По- сле тщательного перемешивания композиты распределяли тонким слоем по полиэтилено- вой плёнке и сушили в кристаллизаторе при комнатной температуре до постоянного веса. На часть «вторичных» гель-плёнок наносили 0,5 % раствор хлоргексидина в ко- личестве 10 мкл на каждый образец, площа- дью 0,25 см2 после помещения его на свежие посевы бактерий. Композит геля бактериальной целлю- лозы с экстрактами, хлоргексидином и диме- тилсульфоксидом (DMSO) содержал 33 % экстракта, 16 % хлоргексидина и 3 % DMSO. Полученные композиты гелей бактери- альной целлюлозы с экстрактом, хлоргекси- дином и DMSO формировались в виде шаро- видных образцов с помощью пинцета и стек- лянных палочек. В качестве контроля исполь- зовались гели с добавлением 96 % этилового спирта в концентрации 52 %. В качестве антибактериального соеди- нения использовали поли-N,N-диметил-3,4- метиленпирролидиний хлорид в виде про- зрачного 15 %-го водного раствора светло-ко- ричневого цвета, имеющего специфический запах. Поли-N,N-диметил-3,4-метиленпирро- лидиний хлорид (полиаллилдиметиламмония хлорид, ПАДМАХ) синтезирован в Инсти- туте химической физики РАН под руковод- ством академика РАЕН, д.х.н., профессора М. И. Черкашина. Раствор полимера был предоставлен фирмой «Формула АГРЭКО». Препарат устойчив к действию высоких тем- ператур, фотолизу и гидролизу. Он обладает малой токсичностью по отношению к живот- ным и человеку (LD50 для крыс - 5560 мг/кг). Минимальная бактерицидная концентрация по отношению к псевдомонадам и ксантомо- надам составляет около 150 мкг/мл Молеку- лярная масса поли-N,N-диметил-3,4-метилен- пирролидиний хлорида при полимеризации составляла 100-150 тыс. Да, рН 7-8, плот- ность 1,03-1,05 г/см3 при 20 °С [2; 3]. Воздей- ствующие концентрации ПАДМАХа гото- вили разведением 15 % раствора в 2 (7,5 %), 4 (3,75 %) и 5 (3 %) раз дистиллированной во- дой и смешивали с гелем в отношении 1:1. Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета. 2018. № 2 (13) 37 Также был использован 2-амино-6-нит- робензотиазол - гетероциклическое органи- ческое соединение, зарегистрированное под номером CAS 6285-57-0. Соединение пред- ставляет собой жёлтое кристаллическое ве- щество, хорошо растворимое в этаноле. При- меняется в химической промышленности и для исследовательских целей [4; 5]. Вещество было синтезировано на кафедре органиче- ской, биоорганической и медицинской химии Самарского национального исследователь- ского университета имени академика С. П. Королева кандидатом химических наук, доцентом Ермохиным В. А. из соответствую- щего производного фенилтиомочевины по методу Хугерсхофа [5]. Для получения «вторичной» плёнки на основе геля БЦ и 2-амино-6-нитробензотиа- зола навеску 50 мг 2-амино-6-нитробензотиа- зола растворяли в 5-ти мл 96 %-ого этилового спирта. Полученный раствор помещали в 10 мл геля, перемешивали в шейкере-инкуба- торе (Environmental Shaker-Incubator ES- 20/60) 20 минут, режим перемешивания - 250 об/мин. Полученную смесь выкладывали в чашку Петри на полиэтиленовую плёнку, оставляли до высыхания. Полученные образцы «вторичных» гель-плёнок перед использованием подверга- лись стерилизации с помощью УФ-облучения или термообработки горячим или сухим па- ром, гели предварительной стерилизации не подвергались с целью сохранения первичного состава. В качестве тест-объектов были исполь- зованы бактериальные культуры Escherichia coli (E. coli) M-17 и Staphylococcus epidermidis NCTC8325-4. Для посевов использовали су- точные инокуляты в минеральной среде Чапека с плотностью популяций от 0,15 до 0,44 единиц оптической плотности (λ = 670 нм, толщина поглощающего слоя 0,5 см). Для изучения антифунгальной активности те- стовым микроорганизмом послужил Aspergillus flavus, штамм был выделен из почвы с ис- пользованием подкисленной среды Чапека. Гриб-сапротроф из рода Aspergillus распро- странён повсеместно - в почве, воде, воздухе, старых книгах, перьевых подушках, кондици- онерах и увлажнителях воздуха. Об антибактериальном действии судили по зонам отсутствия роста вокруг образцов после односуточного или 2-3-х суточного ро- ста на мясо-пептонном агаре при температуре 30 ᴼС. Антифунгальное действие фиксиро- вали после 3-х суточного роста на подкислен- ной среде Чапека. Результаты и их обсуждение «Вторичные» гель-плёнки с добавле- нием экстракта алоэ не характеризовались высоким антибактериальным эффектом, как по отношению к E. coli, так и по отношению к Staphylococcus epidermidis. Рост не наблю- дался только непосредственно под образ- цами. При добавлении во «вторичные» гель- плёнки с экстрактом алоэ 10-ти мкл хлоргек- сидина наблюдается значительный антибак- териальный эффект, выражающийся в увели- чении зон ограничения роста примерно в 4 раза как по отношению к E. coli, так и по от- ношению к Staphylococcus epidermidis. Использование гелей, содержащих только этиловый спирт не эффективно по от- ношению к E. coli, однако даёт значительные зоны ограничения роста Staphylococcus epidermidis. Гель с добавлением экстракта алоэ, хлоргексидина и DMSO более эффекти- вен по отношению к Staphylococcus epidermidis, чем по отношению к E. coli. Зоны ограничения роста при использовании в каче- стве тест-объекта Staphylococcus epidermidis приблизительно в 2 раза больше, чем при ис- пользовании в качестве тест-объекта E. coli. При использовании в качестве носителей «вторичных» гель-плёнок добавление экс- тракта календулы предотвращает рост E. coli только под образцами, зоны ограничения роста вокруг образцов нет. При использовании кон- трольных образцов «вторичных» гель-плёнок наблюдается полное зарастание чашек, вклю- чая область образцов. Ту же закономерность мы наблюдали и в случае использования в ка- честве тест-объекта инокулят Staphylococcus epidermidis. Если же на образцы «вторичных» гель-плёнок, содержащих экстракт календулы, наносили водный раствор хлоргексидина, то наблюдали появление значительных зон огра- ничения роста бактерий (табл. 1). Эффект огра- ничения роста был наиболее выражен по отно- шению к Staphylococcus epidermidis. Диаметр зон отсутствия роста оказался выше на 30 %, чем у E. coli (табл. 1). 38 Биология Таблица 1 Антибактериальное действие гелей и «вторичных» гель-плёнок, содержащих растительные экстракты, хлоргексидин и диметилсульфоксид Характер и состав композита Зоны отсутствия роста, мм Escherichia coli Staphylococcus epidermidis А) «Вторичнаяё гель-пленка с этиловым спиртом (кон- троль); Б) Гель с этиловым спиртом (контроль) нет нет нет 14,30±2,04 А) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом алоэ; Б) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом календулы 5,00 ± 0,13 5,00 ± 0,13 5,00 ± 0,13 5,00 ± 0,13 А) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом алоэ + 10 мкл хлоргексидина; Б) «Вторичная» гель-плёнка с экстрактом календулы + 10 мкл хлоргексидина 18,20 ± 1,95* 18,70 ± 2,13 20,50 ± 1,75* 24,60 ± 1,18*^ А) Гель с экстрактом алоэ, хлоргексидином и DMSO; Б) Гель с экстрактом календулы, хлоргексидином и DMSO 8,90 ± 0,23* 11,00 ± 0,87** 20,80 ± 0,41*^ 23,80 ± 1,17*^ Примечание: * - Р < 0,01 по отношению к контролю; ** - P < 0,01 по отношению к гелю с экстрактом алоэ; ^ - P < 0,05 по отношению к Escherichia coli. Использование гелей БЦ показало, что гель, содержащий этиловый спирт не сдержи- вал рост E. coli, однако обладал выраженным антибактериальным действием по отноше- нию к Staphylococcus epidermidis. Добавление в гели экстракта, хлоргексидина и DMSO ха- рактеризовалось антибактериальным дей- ствием против E. coli, давая задержку роста около 11 мм. Но большую эффективность оказывали на рост Staphylococcus epidermidis. Наблюдаемый эффект был выше, чем у E. coli более, чем в 2 раза (табл. 1). Наблюдали значительную антибактери- альную активность «вторичных» плёнок БЦ с 2-амино-6-нитробензотиазолом, где площадь подавления роста Escherichia coli на третьи сутки культивирования составила 4,43 ± 0,67 см2. В то время как в контрольных чашках отметили практически сплошной газонный рост на самих образцах «вторичных» плёнок и вокруг них. Антифунгальные свойства «вторичных» плёнок БЦ с 2-амино-6-нитро- бензотиазолом выражены слабее, чем анти- бактериальные. Площадь подавления роста Aspergillus flavus на третьи сутки культи- вирования составила 2,37 ± 0,22 см2. В контрольных чашках наблюдали сплошной газонный рост Aspergillus flavus. Эффективным антибактериальным дей- ствием характеризовались «вторичные» гель- плёнки, приготовленные из геля с добавле- нием водных растворов поли-N,N-диметил- 3,4-метиленпирролидиний хлорида различ- ной концентрации (табл. 2). Снижение кон- центрации ПАДМАХа приводит к уменьше- нию антибактериального эффекта по отноше- нию к Escherichia coli (табл. 2). Разведение полимера в пять раз сопровождается сниже- нием диаметра ограничения роста на 27 % и площади отсутствия роста на 51 %. Полученные данные свидетельствуют о том, что использование первично гелей для фи- зической модификации бактериальной целлю- лозы и получение гелей «вторично» из гелей приводит к увеличению антибактериального эф- фекта используемых антибиотических соедине- ний. Полученные ранее данные о применении ПАДМАХа для пропитки сухих и влажных плё- нок БЦ показало, что эффективнее использова- ние влажных плёнок [6]. Ещё более эффектив- ным является использование изначально геля. Вероятно, перемешивание геля с антибиотиче- ским соединением происходит равномерно, со- единение полнее заполняет поры волокон цел- люлозы и антибиотический эффект увеличива- ется. Вестник молодых учёных и специалистов Самарского университета. 2018. № 2 (13) 39 Таблица 2 Зоны задержки роста E. сoli (2-е сутки культивирования) на плотной среде вокруг «вторичных» гель-плёнок БЦ с хлоридом полиаллилдиметиламмония различных концентраций Проба Диаметр зоны огра- ничения роста, мм Площадь отсутствия роста, % Контроль: «вторичная» гель-плёнка БЦ нет 0 «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 15 % раствор ПАДМАХ 14,13 ± 0,23 9,87 ± 0,05 «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 7,5 % раствор ПАДМАХ 12,56 ± 0,15* 7,80 ± 0,03* «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 3,75 % раствор ПАДМАХ 10,75 ± 0,09*^ 5,71 ± 0,02*^ «Вторичная» гель-плёнка БЦ + 3% раствор ПАДМАХ 10,25 ± 0,09* 4,76 ± 0,02*^ Примечание: * - P < 0,01 по отношению к контролю; ^ - P < 0,01 по отношению к предыду- щему разведению ПАДМАХ. Заключение Гели бактериальной целлюлозы могут стать перспективным носителем антибиотиче- ских соединений. Гель легко перемешивается с этиловым спиртом, что приводит к его дезин- фекции по отношению к стафиллококкам. За- тем в гель можно добавить растворы или навески различных соединений, обусловлива- ющих антибактериальные, антифунгальные, иммуностимулирующие, регенерирующие и другие свойства. Гели можно будет применять как в нативном виде, так и в виде высушенных «вторичных» плёнок. Наилучший антибактери- альный эффект достигается при использовании композитов на основе «вторичных» гель-плё- нок, содержащих экстракт календулы или алоэ с добавлением хлоргексидина, причём он выше по отношению к грамположительным неспоро- образующим бактериям (Staphylococcus epidermidis), чем к грамотрицательным (Escherichia coli). Многие соединения, раство- римые в этиловом спирте можно добавлять в виде навески (2-амино-6-нитробензотиазол) и перемешивать гель с веществом в шейкере, что значительно увеличивает его биологический эффект. Для приготовления биологически ак- тивных композитов на основе гелей БЦ можно использовать водные растворы соединений (поли-N,N-диметил-3,4-метиленпирролидиний хлорид, DMSO) и спиртовые экстракты (экс- тракты календулы и алоэ). Благодарности Авторы выражают благодарность науч- ным руководителям: профессору Самарского университета Клёновой Наталье Анатоль- евне, доценту Самарского университета Бело- усовой Зое Петровне за всестороннюю по- мощь и поддержку, заведующему кафедрой бихимии, биотехнологии и и биоинженерии Самарского университета профессору Ревину Виктору Васильевичу и сотрудникам Мор- довского национального исследовательского университета имени Н. П. Огарёва за предо- ставление штамма Gluconacetobacter sucrofermentas H-110 и методическую кон- сультацию по культивированию ацетобакте- рий, а также сотрудникам кафедры биохимии, биотехнологии и биоинженерии Самарского университета за оказанную помощь при вы- полнении исследовательской работы.

About the authors

Dadya Aleksandrovna Evdokimenko

Samara University

Email: puhlenysh97@mail.ru
Samara, Russia

Irina Sergeevna Mazhanova

Samara University

Email: irinamazhanova@gmail.com
Samara, Russia

Valentina Sergeevna Soboleva

Samara University

Email: soboleva.alechka15@mail.ru
Samara, Russia

Elina Yuryevna Sosova

Samara University

Email: ugrh12@mail.ru
Samara, Russia

References

Supplementary files